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143 / INMUNOLOGÍA TUMORAL

La comprensión de los mecanismos involucrados en la inducción de la inmunidad y en la identificación de antígenos por las células efectoras ha mejorado de forma notable en la pasada década a medida que la biología molecular ha unido sus fuerzas con la inmunología tumoral clásica. Este mejor entendimiento molecular ha supuesto el desarrollo de numerosas estrategias terapéuticas nuevas. Por ejemplo, las respuestas inmunitarias pueden sufrir alteraciones importantes cuando se modifica un único aminoácido de un antígeno o un receptor.

Los antígenos asociados a tumores (AAT) son antígenos que se encuentran relativamente restringidos a células tumorales. Los antígenos específicos de tumores (AET) son antígenos que sólo se hallan en células tumorales. El desarrollo de tumores a pesar de la presencia de antígenos, la importancia del reconocimiento inmunitario en la patogenia tumoral y el potencial para estimular terapéuticamente las respuestas inmunitarias son objetos de una intensa investigación.

ANTÍGENOS TUMORALES

Antígenos presentes en células tumorales pero no en células normales.

La mayoría de los tumores inducidos o trasplantados en experimentos animales inmunizan a los receptores singénicos frente a posteriores exposiciones al mismo tumor, pero no contra el trasplante de tejidos normales o de otros tumores. Los antígenos tumorales se demuestran especialmente bien en: 1) tumores inducidos por carcinógenos químicos, que tienden a presentar antígenos específicos que varían de un tumor a otro, incluso entre tumores inducidos por el mismo carcinógeno, y 2) tumores inducidos por virus, que tienden a mostrar reactividad cruzada entre tumores inducidos por el mismo virus. Las infecciones víricas pueden ocasionar una «automodificación», es decir, nuevos antígenos identificados en relación con el complejo principal de histocompatibilidad (MHC).

Los mecanismos sugeridos de origen de estos antígenos incluyen: 1) nueva información genética introducida por un virus, como en el caso de las proteínas E6 y E7 del virus del papiloma humano en el cáncer de cuello uterino; 2) alteración de oncogenes por carcinógenos, que generan directamente una nueva secuencia proteica o provocan la inducción de genes que no se expresan en condiciones normales (excepto quizá durante el desarrollo embrionario); 3) descubrimiento de antígenos normalmente «enterrados» en la membrana celular, ya que las células neoplásicas son incapaces de sintetizar los componentes de la membrana (como el ácido siálico), y 4) liberación de antígenos generalmente retenidos en el interior de la célula o sus organelas cuando mueren las células neoplásicas.

Las técnicas que demuestran la presencia de antígenos tumorales han mejorado en gran medida con la clonación molecular. Diversos antígenos tumorales se han purificado directamente a partir de células cancerosas y se han identificado mediante técnicas fisicoquímicas, como la espectrometría de masas en tándem. Por otra parte, los clones de células T específicos de tumores pueden examinarse frente a células que no poseen el antígeno, pero que lo han adquirido mediante la transfección con clones de ADN plasmídico con el fin de aislar el clon que expresa el antígeno. Posteriormente pueden diseñarse péptidos sintéticos para identificar con precisión la localización o el epítopo antigénico.

Se han identificado algunos AAT y AET en cánceres humanos, como el linfoma de Burkitt, el neuroblastoma, el melanoma maligno, el osteosarcoma, el carcinoma de células renales, el carcinoma de mama y algunos carcinomas GI y pulmonares. Los coriocarcinomas en mujeres poseen antígenos del MHC transmitidos por vía paterna que pueden servir como AET en el desarrollo de una respuesta inmunitaria, la cual posiblemente contribuye a la curación completa de estos tumores mediante quimioterapia. Por desgracia, aunque otros tumores humanos pueden presentar AAT o AET antigénicos, no todos ellos son inmunogénicos en el huésped.

RESPUESTA DEL HUÉSPED FRENTE A LOS TUMORES

INMUNIDAD CELULAR

La importancia de las células linfoides en la inmunidad tumoral se ha demostrado de forma repetida en modelos experimentales animales. Se piensa que la célula T es la principal célula responsable de la identificación directa y la destrucción de las células tumorales. Las células T llevan a cabo una vigilancia inmunológica, de manera que destruyen las células tumorales recién transformadas tras identificar los AAT. En el ser humano pueden crecer clones de células T específicas, los cuales reconocen y destruyen directamente las células tumorales autólogas. Las células T son las únicas que tienen capacidad para destruir células que expresan AAT a nivel intracelular, ya que los fragmentos peptídicos que proceden de estas proteínas intracelulares pueden unirse a antígenos de clase I del MHC en la superficie de la célula tumoral, que a su vez pueden ser reconocidos por receptores existentes en la superficie de las células T. Por este motivo, los antígenos que reconocen los linfocitos T citotóxicos (LTC) no tienen que ser proteínas de la superficie celular, sino que pueden ser proteínas intracelulares e incluso intranucleares. Estas moléculas pueden representar dianas inmunoterapéuticas ideales porque pueden estar directamente relacionadas con las alteraciones de la regulación del crecimiento celular que se asocian al desarrollo del cáncer.

Se ha demostrado la presencia de LTC específicos de tumores en neuroblastomas, melanomas malignos, sarcomas y carcinomas de colon, mama, cuello uterino, endometrio, ovario, testículo, nasofaringe y riñón. No se conoce por completo el significado de las reacciones inmunitarias en el control del crecimiento tumoral, pero parece probable que las células T puedan lesionar las células tumorales in vivo en determinadas circunstancias. Las células agresoras naturales (NK), que pueden destruir células tumorales, también se encuentran en personas sin tumores. Las células NK parecen reconocer determinadas características comunes de las células tumorales, sobre todo los niveles bajos de moléculas de clase I del MHC. Algunas células T requieren la presencia de anticuerpos dirigidos frente a las células tumorales (citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos) para iniciar las interacciones que conducen a la muerte de las células tumorales.

Si bien son aparentemente menos eficaces que los mecanismos citotóxicos mediados por células T, los macrófagos pueden destruir células tumorales específicas cuando se activan en presencia de AAT, linfocinas (factores solubles) sintetizadas por las células T o interferón (IFN). Otras células T, denominadas células T supresoras, inhiben la producción de una respuesta inmunitaria contra los tumores. Las células presentadoras de antígenos también son fundamentales en la inducción de la respuesta inmunitaria. Estas células se encuentran en las barreras tisulares (p. ej., piel y ganglios linfáticos), de manera que presentan nuevos antígenos a células inmunitarias efectoras, como las células T.

Además de las diversas poblaciones celulares, las linfocinas producidas por las células inmunitarias estimulan el crecimiento o inducen actividades de otras células inmunitarias (v. también cap. 144). Entre estas linfocinas se incluyen la interleucina-2 (IL-2), también conocida como factor de crecimiento de células T, y los interferones. Recientemente se han descrito factores de crecimiento, como la interleucina-12 (IL-12), que activan de manera específica a los LCT en vez de suprimir las respuestas de células T y, por tanto, estimulan las respuestas inmunitarias antitumorales.

INMUNIDAD HUMORAL

Los anticuerpos humorales que reaccionan con las células tumorales in vitro se producen como respuesta a diversos tumores animales inducidos por carcinógenos químicos o por virus. Se ha comprobado in vitro la existencia de anticuerpos humorales, dirigidos contra células tumorales humanas o sus constituyentes, en el suero de pacientes con linfoma de Burkitt, melanoma maligno, osteosarcoma, neuroblastoma y carcinomas de pulmón, mama y GI. No obstante, la protección mediada por anticuerpos humorales frente al crecimiento tumoral in vivo sólo puede demostrarse en determinadas leucemias y linfomas animales. Por su parte, la protección mediada por células linfoides in vivo tiene lugar en numerosos tumores animales.

Anticuerpos antitumorales

Los anticuerpos citotóxicos, en general, se fijan al complemento y se dirigen contra antígenos de superficie de densidad relativamente elevada. Los anticuerpos IgM suelen ser más citotóxicos en los sistemas de trasplante que los anticuerpos IgG.

Los anticuerpos estimuladores (anticuerpos bloqueadores) pueden favorecer, en vez de inhibir, el crecimiento tumoral. Por lo general son IgG y posiblemente forman complejos con antígenos solubles. No se conocen bien los mecanismos y la importancia relativa de tal potenciación inmunológica, pero es posible que intervengan inmunocomplejos solubles y células T supresoras. Todavía no está clara la relación que existe entre los anticuerpos citotóxicos y los estimuladores; es decir, se desconoce si estos anticuerpos son distintos entre sí.

ALTERACIONES DE LA INMUNORREACTIVIDAD DEL HUÉSPED

Los tumores que poseen AAT son capaces de crecer in vivo, lo que sugiere la existencia de una respuesta deficiente del huésped frente a los AAT. A continuación se exponen los posibles mecanismos: 1) puede desarrollarse una tolerancia inmunológica específica a los AAT (p. ej., debido a la exposición prenatal a los antígenos, posiblemente de origen vírico). Es posible que las células T supresoras intervengan de alguna manera. 2) Agentes químicos, físicos o víricos pueden suprimir la respuesta inmunitaria. Un ejemplo llamativo de esta última hipótesis se observa en los pacientes con infección por el VIH, en quienes el virus destruye de forma selectiva las células T cooperadoras (v. cap. 163). 3) El tratamiento, especialmente los fármacos citotóxicos y la radioterapia, puede suprimir la respuesta inmunitaria. Los pacientes sometidos a terapia inmunodepresora por trasplante renal presentan una incidencia de tumores 100 veces superior a la esperada, lo que sugiere un deterioro de los mecanismos de vigilancia inmunológica. Por lo general, estos tumores son neoplasias malignas linfoides y no cánceres más prevalentes (p. ej., pulmón, mama, colon o próstata). Los tumores que se han trasplantado de manera inadvertida a receptores de riñones humanos sometidos a terapia inmunodepresora remiten cuando se interrumpe la inmunodepresión. En contraste con estos efectos nocivos de los fármacos inmunodepresores o de la radioterapia, se ha comprobado recientemente que el pretratamiento de los pacientes con cáncer con dosis bajas de ciclofosfamida inhibe las respuestas de células T supresoras frente a vacunas tumorales y otros antígenos, estimulando así potencialmente la inmunidad tumoral. 4) El tumor puede, por sí mismo, suprimir la respuesta inmunitaria. Una inmunidad celular deficiente puede asociarse a recidivas y diseminación de los tumores, aunque es difícil determinar cuál es la causa y cuál es el efecto. Esta deficiencia se ha demostrado repetidas veces en varios tumores, de forma más espectacular en la enfermedad de Hodgkin, en la que ocurre un defecto variable de la función de las células T. También parecen estar implicados una disminución de la producción de IL-2, un aumento de los receptores de IL-2 soluble circulante y defectos inducidos en la función de las células presentadoras de antígenos. Se han demostrado defectos funcionales en las células T que infiltran tumores, las cuales pueden superarse por una presentación antigénica suficiente a cargo de las células presentadoras de antígenos y por un sostén de citocinas adecuado. Los defectos de la inmunidad humoral se asocian con frecuencia a neoplasias en que intervienen derivados de células B anómalas (como mieloma múltiple y leucemia linfocítica crónica).

INMUNODIAGNÓSTICO TUMORAL

Los AAT pueden ser marcadores tumorales útiles en el diagnóstico y el tratamiento de diversos tumores. Un marcador tumoral ideal sólo debe liberarse del tejido tumoral, debe ser específico para un tipo tumoral determinado (para dirigir la valoración diagnóstica), debe ser detectable con niveles bajos de carga tumoral, debe tener una relación directa entre la carga celular tumoral y su concentración en sangre u otros líquidos corporales y debe estar presente en todos los pacientes que padecen el tumor. La mayoría de los tumores liberan macromoléculas antigénicas hacia el interior de la circulación que pueden detectarse mediante inmunoanálisis. Aunque son útiles para controlar a los pacientes en busca de recidivas tumorales posteriores al tratamiento, ninguno tiene especificidad o sensibilidad suficientes que permitan su aplicación en el diagnóstico precoz o en programas poblacionales de detección de cáncer.

El antígeno carcinoembrionario (CEA) es un complejo proteína-polisacárido que se halla en carcinomas de colon y en el intestino, el páncreas y el hígado de fetos normales. Un inmunoanálisis sensible puede detectar concentraciones elevadas en la sangre de pacientes con carcinoma de colon, pero su especificidad es relativamente baja, ya que también se observan pruebas positivas en grandes fumadores y en pacientes con cirrosis, colitis ulcerosa y otros tipos de cáncer (como el de mama, páncreas, vejiga, ovario y cuello uterino). La monitorización de los niveles de CEA puede tener valor para detectar recidivas del cáncer tras su extirpación, siempre que se haya asociado con cifras elevadas de CEA.

La a-fetoproteína, un producto normal de los hepatocitos fetales, también se encuentra en el suero de pacientes con hepatoma primario, neoplasias del saco vitelino y, a menudo, en carcinomas embrionarios testiculares u ováricos.

La subunidad b de la gonadotropina coriónica humana (b-HCG), medida por inmunoanálisis, es el principal marcador clínico en mujeres con neoplasia trofoblástica gestacional (NTG, un espectro de enfermedades que incluye la mola hidatiforme, la NTG no metastásica y la NTG metastásica [v. también Enfermedad trofoblástica gestacional en cap. 241]) y en aproximadamente 2/3 de los varones con coriocarcinoma o cáncer embrionario testicular. Se mide la subunidad b porque es específica para la HCG.

El antígeno prostático específico (PSA), una glucoproteína localizada en las células epiteliales de los conductos de la glándula prostática, puede detectarse en concentraciones bajas en el suero de varones sanos. Seleccionando un límite superior de la normalidad apropiado, los análisis con anticuerpos monoclonales detectan concentraciones séricas elevadas de PSA en alrededor del 90% de los pacientes con cáncer prostático avanzado, incluso en ausencia de enfermedad metastásica definida. Por este motivo, es más sensible que la fosfatasa ácida prostática. No obstante, dado que sus niveles aumentan en caso de hipertrofia prostática benigna, es menos específica. El PSA puede utilizarse para controlar la aparición de recidivas una vez establecido el diagnóstico y el tratamiento del carcinoma prostático.

El CA 125 resulta clínicamente útil para diagnosticar y controlar el tratamiento del cáncer de ovario, si bien cualquier proceso inflamatorio peritoneal puede originar un aumento de sus niveles circulantes.

El anticuerpo monoclonal radiomarcado B72.3, que reconoce un antígeno pancarcinomatoso (uno que reconoce carcinomas de cualquier tejido) denominado TAG-72, se está empleando en estudios de localización tumoral con el fin de hallar depósitos tumorales ocultos. También se está investigando el beneficio clínico que supone encontrar estos tumores ocultos.

INMUNOTERAPIA

Es preferible considerar la inmunoterapia antineoplásica como una parte de un tema más amplio, la terapia biológica, o la aplicación de modificadores de la respuesta biológica (MRB). Estos agentes pueden actuar a través de uno o más mecanismos: 1) estimulación de la respuesta antitumoral del huésped al aumentar el número de células efectoras o al producir uno o más mediadores solubles (p. ej., linfocinas); 2) disminución de los mecanismos supresores del huésped; 3) alteración de las células tumorales para incrementar su inmunogenicidad o volverlas más susceptibles a la destrucción por procesos inmunológicos, y 4) mejoría de la tolerancia del huésped a los fármacos citotóxicos o la radioterapia (p. ej., estimulando la función de la médula ósea con factor estimulador de colonias de granulocitos o con otros factores hematopoyéticos). Los tres primeros mecanismos representan la manipulación de los procesos inmunológicos y se consideran formas de inmunoterapia. Un MRB dado puede presentar efectos inmunológicos y no inmunológicos; así, el IFN-a estimula la expresión de AAT en las células tumorales y aumenta la actividad de las células NK, pero inhibe directamente la proliferación de las células tumorales a través de mecanismos no inmunológicos.

INMUNOTERAPIA CELULAR PASIVA

La inmunoterapia celular pasiva es un término que se emplea cuando se perfunden células efectoras específicas activadas en un paciente y no se inducen o expanden en el interior de éste. Los primeros intentos consistieron en la reinfusión de linfocitos del paciente después de su expansión in vitro por exposición a IL-2 (factor de crecimiento de células T). Estas células se denominan células agresoras activadas por linfocinas (células LAK). En ocasiones, las células se exponen en primer lugar a fitohemaglutinina, un mitógeno linfocitario, con el fin de expandir una amplia variedad de células linfoides periféricas. Tales métodos representan una extensión del trabajo en el que se realizaba una transfusión cruzada de linfocitos alogénicos entre pacientes neoplásicos después de intentar una inmunización con injertos tumorales. La disponibilidad de grandes cantidades de IL-2 recombinante purificada ha permitido que la técnica de células LAK más IL-2 sea factible, habiéndose registrado respuestas objetivas en algunos pacientes con melanoma y carcinoma renal.

Dado que la infusión de IL-2 tras la de células LAK produce una toxicidad significativa, se están investigando algunas variantes de estos métodos. Una técnica consiste en aislar y expandir poblaciones de linfocitos que han infiltrado tumores in vivo y, por tanto, poseen especificidad tumoral (denominados linfocitos infiltrantes de tumores [LIT]). La infusión de LIT permite el empleo de dosis menores de IL-2 con efectos antitumorales iguales o superiores. Los LIT también pueden modificarse genéticamente para conseguir que expresen moléculas tumoricidas y se incremente su citotoxicidad.

Otra variante de la inmunoterapia celular pasiva consiste en la utilización simultánea de interferón, que estimula la expresión de antígenos del MHC y de AAT sobre las células tumorales, aumentando así la destrucción de éstas por parte de las células efectoras infundidas. No obstante, las remisiones son infrecuentes.

INMUNOTERAPIA HUMORAL PASIVA

El empleo de anticuerpos antitumorales como forma de inmunoterapia pasiva (en contraste con la estimulación activa del sistema inmunitario del huésped) se realiza, al menos, desde hace un siglo. La tecnología de los hibridomas ha incrementado el potencial de este tipo de técnicas de inmunoterapia humana, ya que permite la detección y producción in vitro de anticuerpos antitumorales monoclonales dirigidos frente a diversas neoplasias animales y humanas.

Se ha utilizado suero antilinfocítico en las leucemias linfocíticas crónicas y en los linfomas de células B y T, obteniendo disminuciones transitorias de los recuentos de linfocitos o del tamaño de los ganglios linfáticos. Algunos estudios sobre anticuerpos monoclonales murinos contra diversos antígenos asociados a melanomas malignos y linfomas han comprobado respuestas significativas; en la actualidad se emplean «anticuerpos humanizados» para evitar la reacción inmunitaria contra las inmunoglobulinas de ratones.

Otra variante es la conjugación de anticuerpos antitumorales monoclonales con toxinas (como ricina, difteria) o con radioisótopos, de modo que los anticuerpos cedan estos agentes tóxicos de forma específica a las células tumorales. Un nuevo método, en el que se utilizan mecanismos celulares y humorales, es el desarrollo de anticuerpos biespecíficos, en los que se une un anticuerpo que reacciona con la célula tumoral con un segundo anticuerpo que reacciona con una célula efectora citotóxica, lo que origina que esta última se dirija más específicamente contra el tumor.

INMUNOTERAPIA ESPECÍFICA ACTIVA

Las técnicas diseñadas para inducir inmunidad celular terapéutica en el huésped que padece un tumor son más prometedoras que los métodos de inmunoterapia pasiva. La inducción de inmunidad en un huésped que no consiguió desarrollar una respuesta eficaz en primera instancia requiere procedimientos especiales para presentar los antígenos tumorales a las células efectoras del huésped. Con este objetivo se emplean células tumorales intactas, antígenos tumorales definidos e inmunoestimuladores generales.

Se han utilizado células tumorales autóctonas (células procedentes del huésped), después de irradiación, tratamiento con neuraminidasa, conjugación con haptenos o hibridación in vitro con líneas celulares a largo plazo, en pacientes con carcinoma renal y melanoma maligno, entre otros. Más recientemente se han empleado con éxito en estudios animales técnicas que utilizan células tumorales modificadas genéticamente para producir moléculas inmunoestimuladoras (incluidas citocinas como el factor estimulador de colonias de granulocitos y macrófagos o la IL-2, moléculas coestimuladoras como la B7-1 y moléculas alogénicas de clase I del MHC) y ya se están evaluando en ensayos clínicos en humanos.

Las células tumorales alogénicas (células procedentes de otros pacientes) se han utilizado en pacientes con leucemias linfoblásticas agudas y leucemias mieloblásticas agudas. En primer lugar, se induce la remisión con quimioterapia intensiva y radioterapia; a continuación se inyectan células tumorales alogénicas irradiadas junto con vacuna de bacilo de Calmette-Guérin (BCG) u otros adyuvantes (v. más adelante). En algunas series, pero no en la mayoría, se han descrito remisiones prolongadas o mejoría de las tasas de reinducción,

Las vacunas basadas en antígenos tumorales definidos se encuentran entre los métodos más prometedores en inmunoterapia antineoplásica. Una ventaja del empleo de antígenos definidos radica en que puede evaluarse fácilmente la eficacia de la técnica de inmunización, ya que se dispone de un punto terminal definido (es decir, respuestas medibles frente a un péptido específico). Un número creciente de antígenos tumorales se han identificado inequívocamente como diana de células T específicas procedentes de pacientes con cáncer, que incluyen antígenos con una secuencia normal que se expresan de forma inapropiada en el tumor y antígenos derivados de genes que han mutado durante el desarrollo del tumor (p. ej., oncogenes). Los linfomas de células B poseen un antígeno único que procede de la región variable de la secuencia de inmunoglobulinas que se expresan clonalmente (el idiotipo). Este hecho es característico de las células tumorales pero varía entre los pacientes.

La inmunidad celular (incluidas las células T citotóxicas) frente a antígenos específicos bien definidos puede inducirse in vitro utilizando péptidos sintéticos cortos unidos a adyuvantes o a células presentadoras de antígenos autólogas (impulso antigénico). Estas células presentadoras de antígenos se reintroducen por vía intravenosa y estimulan las células T del paciente para que respondan a los antígenos peptídicos «impulsados». Los primeros ensayos clínicos realizados han obtenido respuestas notables. La inmunización con secuencias de idiotipos que sintetizan y expresan las células de linfomas B ha demostrado tasas de respuesta significativas.

También puede inducirse una inmunidad específica de antígeno con virus recombinantes (como adenovirus o virus vacuna) que expresan AAT como el CEA. Se está evaluando la eficacia antitumoral de estos virus suministradores de antígenos.

INMUNOTERAPIA INESPECÍFICA

Los interferones (IFN) derivados de leucocitos (IFN-a e IFN-g) o fibroblastos (IFN-b), o sintetizados en bacterias mediante técnicas de genética recombinante, son glucoproteínas con actividad antitumoral y antivírica, que pueden originarse parcialmente a partir de mecanismos mediados inmunológicamente. Dependiendo de la dosis, los IFN pueden estimular o reducir las funciones inmunitarias humorales y celulares, así como afectar la actividad de los macrófagos y las células NK. Los IFN también inhiben la división y ciertos procesos de síntesis en diversas células. Los ensayos clínicos realizados en humanos han indicado que los IFN presentan actividad antitumoral en la leucemia de células peludas, la leucemia mieloide crónica y el sarcoma de Kaposi asociado al SIDA. Aunque en menor grado, también se ha observado cierta reactividad en los linfomas no Hodgkin, el mieloma múltiple y el carcinoma de ovario. No obstante, los IFN son bastante tóxicos, de manera que los pacientes pueden desarrollar fiebre, malestar general, leucopenia, alopecia y mialgias.

Los adyuvantes bacterianos (p. ej., bacilo tuberculoso atenuado [BCG], extractos de BCG [p.ej., residuos extraídos con metanol] o suspensiones destruidas de Corynebacterium parvum) se han empleado en ensayos aleatorizados con o sin antígeno tumoral añadido para tratar una amplia variedad de cánceres, generalmente asociados a quimioterapia intensiva o radioterapia. La inyección directa de BCG en el interior de nódulos de melanoma casi siempre conduce a la remisión de los nódulos inyectados y, en ocasiones, de nódulos distantes no inyectados. La instilación intravesical de BCG en pacientes con carcinoma superficial de vejiga ha logrado la prolongación de los intervalos libres de enfermedad, como consecuencia, posiblemente, de mecanismos inmunológicos. Algunos estudios sugieren que los residuos extraídos con metanol pueden contribuir a prolongar la remisión inducida por citostáticos en la leucemia mieloblástica aguda y que la adición de BCG a la poliquimioterapia puede aumentar la supervivencia en los pacientes que padecen carcinomas de ovario y, probablemente, linfomas no Hodgkin. Sin embargo, numerosos estudios no han demostrado beneficio alguno.